數(shù)字分光光度計原理是我們從事實驗室儀器研究和應(yīng)用的人員需要掌握的知識。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析的儀器。該儀器是實驗室、科研機構(gòu)、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品廠、飲用水廠等機構(gòu)*檢驗設(shè)備。已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。
數(shù)字分光光度計常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。分光光度計基本原理是指采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比。
數(shù)字分光光度計詳細情況如下：
組成部分一：電光系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中主要是由鎢燈和相應(yīng)的電源組成，這種系統(tǒng)對整體的穩(wěn)定性就有很大影響，當(dāng)該系統(tǒng)不能正常工作后也會導(dǎo)致儀器工作不穩(wěn)定。
組成部分二：光學(xué)系統(tǒng)。這種系統(tǒng)包括有外光路系統(tǒng)和單色器2個主要部分，其中外光路和單色器都有很多類型，單色器就是紫外可見分光光度計散光的主要來源。
組成部分三：光電系統(tǒng)。該系統(tǒng)是紫外可見分光光度計zui關(guān)鍵的部件，系統(tǒng)會直接影響到儀器中的靈敏度和適用范圍，里面有光電倍增管、光電管、二極陣列和硅光電池等。
組成部分四：電子系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中主要有放大器和A/D變換器等組成，其中放大器就是影響整機靈敏度和穩(wěn)定性的主要相關(guān)部件。
組成部分五：輸出打印系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。該系統(tǒng)是決定整機自動化程度的關(guān)鍵部件，能夠直接影響紫外可見分光光度計的質(zhì)量。
物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r操作。
數(shù)字分光光度計原理說明的這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
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